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甲基化對限制酶酶切的影響

DNA甲基轉移酶(MTases)普遍存在于原核和真核生物中,它能將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移到腺嘌呤或胞嘧啶上。當使用限制性內切酶消化DNA時,要考慮DNA是否有甲基化的問題,因為如果識別序列中某個特定堿基被甲基化后,切割就會被完全或者不完全阻斷。


原核生物甲基化

在原核生物中,DNA甲基轉移酶作為限制修飾系統的一個組成部分廣泛存在,它們的作用是保護宿主菌不被相應的限制性內切酶切割。大多數實驗室使用的大腸桿菌表達三種位點特異性的DNA甲基轉移酶。

  1.   Dam甲基轉移酶能將甲基轉移到GATC序列中的腺嘌呤N6位點上。

  2.   Dcm甲基轉移酶能在CCAGG和CCTGG序列內部的胞嘧啶C5位置上甲基化(下圖中W=A或T)。

  3.   EcoKI甲基轉移酶可將AAC (N6A) GTGC和GCAC (N6A)GTT上的腺嘌呤進行甲基化修飾。


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如果限制性內切酶的切割對象是從表達Dam或Dcm甲基轉移酶的菌株中分離得到的,并且其甲基化識別位點與內切酶識別位點有重疊,那么該限制性內切酶的部分或全部酶切位點有可能被阻斷。例如,從dam+ E.coli 中分離的質粒DNA完全不能被識別序列為T/GATCA的BclI所切割。


E.coli 菌株中的DNA甲基化程度并不完全相同。如pBR322 DNA能被完全甲基化,而λ DNA只有大約50%的Dam位點被甲基化,這是因為在λ DNA被包裝到噬菌體頭部之前,甲基化酶還沒來得及將DNA完全甲基化。因此,被Dam或Dcm甲基化完全阻斷的內切酶只能對這些λ DNA進行部分切割。


質粒DNA上被Dam或Dcm甲基化阻斷的限制性位點可以通過克隆方法去除甲基化,即將質粒DNA轉化至dam-/dcm-菌株(如 JM110)中進行繁殖。


如果出現甲基化位點與酶切位點重疊,內切酶酶切也會被阻遏。在這種情況下,Dam或者Dcm序列一部分來自內切酶識別序列,另一部分為識別序列左右旁側的序列。在設計內切酶酶切時也應該考慮到這種情況。如內切酶XbaI識別序列為T/CTAGA,若其左側序列為GA或右側序列為TC,且該DNA是從damE.coli 中分離得到時,XbaI酶切會被阻斷。


真核生物甲基化

在高等真核生物中發現的CpG甲基轉移酶(CpG MTases),能將甲基基團轉移至胞

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嘧啶殘基上的C5位點。CpG甲基化形式受 遺傳因素的影響,具有組織特異性,并與基因表達相關。在使用限制性內切酶消化真核基因組DNA時尤其要關注CpG甲基化的影響。需要注意的是,一旦DNA被克隆到細菌中后,將不存在CpG甲基化形式。





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